細胞培養中污染的預防與清除

     一、污染的預防
    預防是防止細胞培養過程中發生污染的zui好辦法。只有預防工作做在前，才能將發生污染的可能性降到zui小程度。一般預防可從以下幾方面著手：

    （一）從操作者做起
    1、操作者責任心要強，要細心穩重，操作技術要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規定穿隔離衣。進入后關好門，坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養物，不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用，以免造成大批污染。

    2、操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

    3、操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔整齊，zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

    （二）從物品、用品消毒滅菌著手
    細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

    （三）防止細胞交叉污染
    在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分，zui好做上標記便于辨別。并按順序進行操作，避免一起進行時易發生混亂。

    在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。

    所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應及早留種凍存，一旦發生污染可棄之復蘇，重新培養。

    二、污染的清除
    培養細胞一經污染，多數較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之；有細胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養。若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

    （一）使用抗生素
    抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素（青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL），污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規培養液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環素處理，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進行治療。近年來有報道，4-氟，2-羥基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素衍生物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環素衍生物（BM-2）等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液，-20℃保存備用，使用濃度Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養液，加入含BM-1的RPMI1640培養液，3天后再吸除培養液，加入含BM-2的RPMI1640培養液，培養4天，如此連續3個輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后，再加正常培養液培養傳代3-4次。

    （二）使用支原體特異性血清
    用5%的兔支原體免疫血清（血凝效價1:320以上）可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經濟。

    （三）加溫處理
    將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行預試驗，摸索能zui大限度殺死支原體又對細胞影響zui小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳。

    （四）其他方法
    除了上述去除污染的方法外，還有動物體內接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培養瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價值，一般均棄之重新培養。

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